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英文題目：The Microbiome and Metabolites in Fermented Pu-erh Tea as Revealed by High Throughput Sequencing and Quantitative Multiplex Metabolite Analysis 中文題目：通過高通量測序和定量多重代謝產物分析發(fā)酵普洱茶微生物組及其代謝產物 期刊名：PLoS One 發(fā)表時間：2016.6 IF：3.057 技術：真菌ITS1區(qū)擴增子測序和細菌16S V4區(qū)擴增子測序 測序平臺：Illumina Miseq測序平臺 材料：7片野茶樹新鮮葉片&31個普洱茶葉片樣本（15個生茶&16個熟茶） 分析方法： • ITS1擴增子測序使用UNITE數(shù)據(jù)庫; • 16SV4擴增子測序使用Greengenes數(shù)據(jù)庫; • QIIME計算alpha多樣性(observed richness, Chao 1, Shannon, Simpson Evenness); • PCoA&NMDS分析beta多樣性; • R中vegan軟件包進行群落相似差異性分析（Adonis&ANOSIM）; • Venn圖比較組間共有和特異OTU類群; • 使用R中indicspecies軟件包篩選組間代表性物種; • Mantel檢驗真菌和細菌群落組成的潛在相互關系; 研究背景: 茶在中國是最受歡迎和流行的消費飲品之一。常常產自于兩種不同類型的茶樹上，野茶樹和普洱茶樹。根據(jù)不同的處理過程，茶至少分為6中類型：綠茶，黃茶，白茶，紅茶和黑茶。它們當中黑茶是最特別地，由于黑茶發(fā)酵過程中微生物的變化，將持續(xù)數(shù)月或者許多年。普洱茶就是黑茶的一種，分為生茶和熟茶的兩種葉片類型。一種是傳統(tǒng)的生茶原始發(fā)酵方式得來稱為生茶，一種是速度較快的熱熟茶的發(fā)酵方式成為熟茶。雖然一些研究已經調查了不同發(fā)酵時間普洱茶的微生物多樣性，但沒有人研究過新鮮葉片，生茶以及熟茶葉片去微生物群落特征，及細菌群落和真菌群落組成以及與環(huán)境因子之間的關聯(lián)性。研究者采集了中國云南的7片野茶樹新鮮葉片和31個普洱茶葉片樣本（15生茶和16熟茶），旨在解決以下問題：1.鑒別普洱茶中微生物多樣性和組成；2.比較新鮮葉片，自然加工普洱茶以及熟茶普洱茶中的微生物群落結構; 3.找出影響普洱茶微生物群落的潛在因素; 4.鑒定出普洱茶中的微生物代謝產物。 研究結果： 微生物物種豐度和群落組成 通過真菌ITS1區(qū)和細菌16SV4區(qū)擴增子高通量測序，每個樣本含有超過了42383條真菌ITS序列和29721條細菌序列。進一步去除singleton，Chimera序列以及一些低豐度的OTU序列，得到每個樣本約39507-214960條真菌序列和66-305472條細菌序列。通過與其它樣本比較，發(fā)現(xiàn)新鮮葉片和一些生茶茶葉樣本中細菌序列數(shù)目過少是由于序列中葉綠體序列過多導致（圖1），新鮮葉片中占86.23%（紅色線條），生茶葉片中約占65.81%（藍色線條），而熟茶葉片中僅有0.09%（橙色線條），這些序列在分析中會被去除。最后去除物種豐度低于0.005%的序列共得到了390個真菌OTU（每個樣本65-175個OTU）和629個細菌OTU（每個樣本18-466個OTU）。
圖1：葉綠體序列在每個樣本細菌序列中的比例。 圖2顯示大多數(shù)真菌物種隸屬于子囊菌門（305個OTU，91.67%），細菌物種隸屬于放線菌門（172個OTU，43.16%），厚壁菌門（220個OTU，37.01%）和變形菌門（158個OTU，13.89%）。
圖2：分配到每個真菌/細菌門的相對比例。對真菌來說，無論是OTUs (a)還是序列(b)子囊菌門是最豐富的。對細菌來說，無論是OTUs (c)還是序列(d)放線菌門，變形菌門和厚壁菌門是豐度最高的。 新鮮葉片，生茶和熟茶的普洱茶葉片中微生物群落比較 將三種不同類別的葉片序列通過Venn圖分析發(fā)現(xiàn)（圖3.a&圖3.b），真菌物種中僅1/4（107/390）序列，細菌物種中僅1/6（107/629）序列為三種不同類別葉片所共有，暗示三種不同類型葉片中微生物群落組成的差異顯著性。從共有OTU數(shù)目統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)新鮮葉片和普洱茶葉片（生茶和熟茶）共享54%（173/318）的真菌物種和22%（138/625）的細菌物種，表明新鮮葉片是普洱茶發(fā)酵過程中重要的微生物儲備場所。此外，為篩選出每個樣本類型中特異OTU對微生物群落的影響，對三種葉片類型的前100個豐度最高的OTU進行Venn圖分析（圖3.c&圖3.d），發(fā)現(xiàn)三種不同類型葉片中共有的真菌和細菌比例急劇上升。
圖3：新鮮葉片（紅色），生茶（藍色）和熟茶（橙色）的普洱茶Venn圖分析 將不同樣本序列抽頻到相同的序列深度進行alpha多樣性預估（圖4），發(fā)現(xiàn)新鮮葉片（紅色）比生茶（藍色）和熟茶（橙色）的普洱茶葉片有著更多的真菌物種和更少的細菌物種。
圖4：新鮮葉片（紅色），生茶（藍色）和熟茶（橙色）細菌（a）和真菌（b）物種豐度的稀釋性曲線分析 真菌中（圖5.a-d），新鮮葉片和普洱茶葉片（生茶和熟茶）的alpha多樣性指數(shù)（observed species、Chao1、Shannon、Simpson-e）有著顯著性差異，而生茶和熟茶的普洱茶葉片之間均無顯著性差異。細菌中（圖5.e-h），熟茶的普洱茶葉片中的豐富度比新鮮葉片和生茶的葉片顯著性升高，而香農和辛普森指數(shù)未顯著性升高。
圖5：新鮮葉片（紅色），生茶（藍色）和熟茶（橙色）細菌和真菌的alpha多樣性分析 使用PCoA（圖6）和NMDS（圖7）分析了真菌和細菌群落Beta多樣性，結果均顯示出一致性結果，即在新鮮葉片和普洱茶葉片（生茶和熟茶）之間細菌群落組成有顯著性差異。有趣的是發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時間最老的普洱茶葉片（A6）與熟茶的普洱茶葉片更具有群落相似性，尤其是在真菌群落結構中。且通過ANOSIM和ADONIS分析對群落相似性進行檢驗（表1），結果顯示三種不同葉片類型的微生物群落結構均有顯著性差異。
圖6：新鮮葉片（紅色），生茶（藍色）和熟茶（橙色）真菌(a)和細菌(b)的PCoA分析。藍色箭頭所指的是發(fā)酵時間最老的普洱茶葉片（A6，28年）。
圖7：新鮮葉片（紅色），生茶（藍色）和熟茶（橙色）真菌(a)和細菌(b)的NMDS分析。
表1：新鮮葉片，生茶和熟茶之間真菌和細菌的ANOSIM和ADONIS分析。 此外，通過R中indicspecies軟件包在不同類型葉片中篩選出許多指示性物種（表2），發(fā)現(xiàn)熟茶的普洱茶葉片的指示物種為一些嗜熱或者耐熱真菌和細菌，兩個指示性物種（曲霉菌和Blastobotrys adeninivorans）在普洱茶葉片（生茶和熟茶）中被發(fā)現(xiàn)，它們可以作為普洱茶葉片中主要的兩大指示性物種，而這個結果也被先前的可培養(yǎng)研究和不可培養(yǎng)研究結果所證實。
表2：在新鮮葉片，生茶和熟茶中檢測到的真菌/細菌指示物。 外界因素對普洱茶葉片群落結構變異的影響 研究者調查了4個外界因素對普洱茶葉片群落變異的影響，包括時間，產地，純茶VS污染的茶葉，未壓縮茶葉VS壓縮茶葉等。為了研究葉片發(fā)酵時間對微生物群落變異的影響，研究者將生茶和熟茶的普洱茶葉片樣本分成兩組（幼葉片和老葉片），或者三組（幼嫩，半老和老葉片）。在上述幾種外界因素中，只有葉片發(fā)酵時間顯著影響著群落結構，通過ANOSIM和ADONIS分析比較發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時間僅僅對生茶造成顯著性影響。熟茶和相對應時間生茶有著相似的微生物群落，且與那些發(fā)酵時間短的生茶葉片有著明顯區(qū)別。
表3：ANOSIM和ADONIS分析檢測四個外界因素對生茶和熟茶真菌和細菌的群落結構變異的影響。 Mantel檢驗真菌和細菌群落間的相關性。發(fā)現(xiàn)在生茶中真菌和細菌兩種微生物群落間無相關性。而16個熟茶的真菌和細菌群落之間有顯著性相關性（P=0.004），當去除有其它植物污染的7個熟茶茶葉樣本時發(fā)現(xiàn)熟茶的茶葉真菌和細菌群落之間也無顯著相關性。
表4. Mantel檢驗生茶和熟茶的真菌和細菌群落間的相關性 普洱茶葉片中產毒真菌及其毒素 存在于所有樣本中的15個最高豐度真菌中有幾個真菌是產毒真菌，例如尼日爾曲霉、局限曲霉、桔青霉。接著對所有的普洱茶葉片樣本通過LC-MS/MS進行真菌毒素檢測，共發(fā)現(xiàn)了25個化學物質，大多數(shù)化合物濃度都很低。其中5個在所有的葉片中被發(fā)現(xiàn)，包括:asperglaucide, brevinamide F, emodine, neoechinulin A, andusnic acid等，并且asperglaucide無論是在生茶還是熟茶的葉片中濃度都是最高的。
圖8：生茶（藍色）和熟茶中真菌毒素檢測。 結果總結： 這是一篇比較典型利用miseq測序平臺結合真菌ITS區(qū)與細菌16S區(qū)域對微生物多樣性以及群落組成等展開研究，探究真菌群落與細菌群落之間的相關性。適合推薦給真菌與細菌群落多樣性結合研究的客戶。 1.群落組成分析：在新鮮葉片和生茶或者熟茶發(fā)酵的普洱茶葉片之間細菌群落組成顯示出顯著性差異。 2. alpha多樣性分析：生茶或者熟茶發(fā)酵的普洱茶葉片真菌群落多樣性降低，細菌群落多樣性升高。 3. Beta多樣性分析：熟茶和相對應時間生茶的普洱茶葉片有著相似的微生物群落，且與那些發(fā)酵時間短的生茶葉片有著明顯區(qū)別。 4.外界因素：時間顯著影響著生茶發(fā)酵的普洱茶葉片，而熟茶則顯示出相反的趨勢。 5.其他分析（如毒素代謝產物檢測）：對茶葉片樣本通過LC-MS/MS進行真菌毒素檢測，共發(fā)現(xiàn)了25個毒素代謝產物，其中asperglaucide酰胺類和棒曲霉素占據(jù)主導地位 。
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