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英文題目：In silico analyses of metagenomes from human atherosclerotic plaque samples 中文題目：人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊樣本的宏基因組學(xué)分析 期刊名：Microbiome 發(fā)表時(shí)間：2015 IF：9 技術(shù)：宏基因組測(cè)序 測(cè)序平臺(tái)：Illumina HiSeq2000測(cè)序平臺(tái)(PE100) 材料：（1）有癥狀的不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊（case）：是從15例由于近期經(jīng)受短暫腦缺血或輕微中風(fēng)患者的頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)中獲得的。（2）無(wú)癥狀的穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊（control）：是從7個(gè)患者的尸檢中獲得，這組患者的死因與心血管疾病無(wú)關(guān)。取3–5毫米厚的組織，立即儲(chǔ)存于−80 °C。 研究背景: 動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一組動(dòng)脈硬化的血管病中常見(jiàn)的最重要的一種，其特點(diǎn)是受累動(dòng)脈病變從內(nèi)膜開(kāi)始。一般先有脂質(zhì)和復(fù)合糖類(lèi)積聚、出血及血栓形成，纖維組織增生及鈣質(zhì)沉著，并有動(dòng)脈中層的逐漸蛻變和鈣化，病變常累及彈性及大中等肌性動(dòng)脈，一旦發(fā)展到足以阻塞動(dòng)脈腔，則該動(dòng)脈所供應(yīng)的組織或器官將缺血或壞死。由于在動(dòng)脈內(nèi)膜積聚的脂質(zhì)外觀呈黃色粥樣，因此稱(chēng)為動(dòng)脈粥樣硬化。不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是導(dǎo)致斑塊破裂、潰瘍致使動(dòng)脈內(nèi)血栓形成從而引起卒中的主要發(fā)病機(jī)制，具有極大的危害性。 通過(guò)觀察和機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)微生物感染能引起心血管疾病，血管壁的直接感染在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，例如能夠促進(jìn)引起內(nèi)皮功能障礙的炎癥反應(yīng)發(fā)生，并產(chǎn)生導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成的環(huán)境，最終導(dǎo)致心血管疾病，如急性心肌梗死或中風(fēng)?，F(xiàn)在已經(jīng)有一些從動(dòng)脈粥樣硬化血管中分離出活性微生物的相關(guān)研究，然而目前關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化血管的微生物感染的高通量調(diào)查研究是非常有限的。 研究結(jié)果： 測(cè)序和數(shù)據(jù)處理 所有22個(gè)動(dòng)脈斑塊樣品共產(chǎn)生2610268774條reads，然后把這些序列和人類(lèi)Hg19基因組比對(duì)，沒(méi)有比對(duì)上Hg19基因組的reads平均數(shù)是884727044（每個(gè)樣本平均有33.89%，表1）。將這些non-hg19 reads與NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，然后將PE reads輸入到MEGAN5軟件。
表1：樣本統(tǒng)計(jì)和序列比對(duì) 分類(lèi)學(xué)注釋 所有non-hg19注釋reads有2%-16%（平均4.6%）被分類(lèi)為細(xì)菌，其余的是真核生物。表1展示了測(cè)序序列統(tǒng)計(jì)和不同階段數(shù)據(jù)處理后的序列分配結(jié)果。圖1描述了所有22個(gè)樣品屬水平的層次聚類(lèi)結(jié)果。有趣的是，樣品238和p0613是和其它樣品最不同的，所有不穩(wěn)定斑塊樣品（case組）聚集到一起，而所有穩(wěn)定斑塊樣品（control組）也聚集到一起。相比于不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，穩(wěn)定硬化斑塊有更高的宿主微生物豐度，例如紫單胞菌科、鏈球菌科、擬桿菌科、微球菌科（圖1）。相反的是，相對(duì)于穩(wěn)定斑塊樣品，不穩(wěn)定斑塊樣品有更多病原微生物，如螺旋桿菌科、奈瑟氏球菌科、硫消費(fèi)家族如硫氧化共生體和硫發(fā)菌科（圖1）。
圖1：來(lái)自15例有癥狀動(dòng)脈粥樣硬化性患者（實(shí)驗(yàn)組）的不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和7例死于其它原因患者（對(duì)照組）的穩(wěn)定斑塊的分層聚類(lèi)結(jié)果。 從序列統(tǒng)計(jì)（表1），多樣性指數(shù)分析（表2），稀釋性曲線（圖2）明顯可以看出22個(gè)樣本中有2個(gè)樣本(樣本233和238)比其它樣本有更多的物種數(shù)。
圖2：22個(gè)樣品（不穩(wěn)定斑塊樣品和不穩(wěn)定斑塊樣品）的物種稀釋性曲線
表2：多樣性指數(shù)分析 另外PCoA分析和UPGMA樹(shù)展現(xiàn)不穩(wěn)定斑塊樣品和不穩(wěn)定斑塊樣品分別聚類(lèi)在一起（圖3），只有3個(gè)樣本(樣本233, 238和P0613)是分離的，對(duì)于樣本233, 238這可能是由于這兩個(gè)樣本有較多的物種數(shù)造成的，對(duì)于樣本P0613這可能是由于這個(gè)樣本的物種圖譜與其它物種有明顯不同造成的（圖1）。
圖3：22個(gè)樣品（不穩(wěn)定斑塊樣品和不穩(wěn)定斑塊樣品）的PCoA分析圖和UPGMA樹(shù)。不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊樣品用白色圓圈表示，7個(gè)穩(wěn)定斑塊樣品（對(duì)照組）用灰色圓圈表示。
科水平下的分類(lèi)學(xué)系統(tǒng)組成樹(shù)展示了不穩(wěn)定斑塊樣品和不穩(wěn)定斑塊樣品在不同分類(lèi)上的相對(duì)豐度差異。
圖4：所有樣品（不穩(wěn)定斑塊樣品和不穩(wěn)定斑塊樣品）科水平下的分類(lèi)學(xué)系統(tǒng)組成樹(shù)。不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊樣品用白色表示，7個(gè)穩(wěn)定斑塊樣品（對(duì)照組）用灰色表示。一些可能是人類(lèi)起源的物種被標(biāo)記為黑色的十字架。 圖5展示了所有樣本中豐度最高的25個(gè)菌種，不穩(wěn)定斑塊樣品（case組）中豐度最高的是鼠李糖乳桿菌MTCC 5462，多糖奈瑟球菌ATCC 43768，幽門(mén)螺旋桿菌Hp P-4，食酸菌屬CF316，并且這些菌的豐度在不穩(wěn)定斑塊樣品和不穩(wěn)定斑塊樣品中存在差異，提示這些菌可能參與促進(jìn)無(wú)癥狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊向有癥狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的轉(zhuǎn)變。
圖5：所有樣本中豐度最高的25個(gè)菌種，不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊樣品用白色表示，穩(wěn)定斑塊樣品（對(duì)照組）用灰色表示。 功能分析和總生物群落的比較 使用SEED和KEGG分類(lèi)對(duì)總生物群落進(jìn)行功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)代謝和疾病通路方面不穩(wěn)定斑塊樣品和不穩(wěn)定斑塊樣品之間存在明顯差異（圖6），并且都參與“碳水化合物”、“氨基酸”和“能量”等有關(guān)代謝。另外也與“心血管疾病“、“循環(huán)系統(tǒng)”、“免疫系統(tǒng)”、“細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡”與“傳染病”等疾病相關(guān)通路。
圖6：使用SEED（a）和KEGG（b）分類(lèi)對(duì)總生物群落進(jìn)行功能分析，不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊樣品用白色表示，穩(wěn)定斑塊樣品（對(duì)照組）用灰色表示。 為了確定斑塊樣品中細(xì)菌種類(lèi)的生長(zhǎng)生理學(xué)，從豐度最高的細(xì)菌種類(lèi)中挑出兩個(gè)菌種（嗜酸菌和幽門(mén)螺桿菌）使用FISH方法（使用嗜酸菌和幽門(mén)螺桿菌的特異探針以及兩個(gè)陰性探針TM7，Paracoccus spp）分析它們?cè)诓煌∪税邏K樣品中的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗜酸菌和幽門(mén)螺桿菌在動(dòng)脈粥樣硬化組織中以不同形態(tài)形式聚類(lèi)在一起(圖7a, b)，相反使用陰性探針TM7，Paracoccus spp在樣品中沒(méi)有檢測(cè)到任何信號(hào)(圖7c, d)。
圖7：嗜酸菌和幽門(mén)螺桿菌在在幾個(gè)不同患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊標(biāo)本中的FISH影像。（a）嗜酸菌特異探針檢測(cè)結(jié)果；（b）幽門(mén)螺桿菌特異探針檢測(cè)結(jié)果；（c）陰性對(duì)照探針TM7檢測(cè)結(jié)果；（d）陰性對(duì)照探針Paracoccus spp.檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果總結(jié)： 為了調(diào)查動(dòng)脈粥樣硬化組織樣品內(nèi)的微生物多樣性，采用了高通量測(cè)序?qū)τ邪Y狀的不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊（case）和無(wú)癥狀的穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊（control）進(jìn)行微生物宏基因組分析。結(jié)果提示在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在很多微生物，并觀察到這些微生物在癥狀斑塊和無(wú)癥狀斑塊這兩組患者之間具有明顯差異，從而確定了促進(jìn)無(wú)癥狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊向有癥狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊轉(zhuǎn)變的重要細(xì)菌。另外功能注釋表明基本代謝和疾病途徑在這兩組患者之間存在明顯的差異。
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