|
本方法非常適合對(duì)大量樣品進(jìn)行多個(gè)目的片段或者目的區(qū)域的DNA拷貝數(shù)檢測(cè)研究。
技術(shù)方法：
上海天昊生物科技有限公司開(kāi)發(fā)的AccuCopy®多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)專(zhuān)利技術(shù)（專(zhuān)利號(hào)：201010180551.2），根據(jù)客戶項(xiàng)目要求合成特異引物和競(jìng)爭(zhēng)模板，以及優(yōu)化PCR反應(yīng)體系后組裝而成。該專(zhuān)利技術(shù)原理說(shuō)明見(jiàn)圖1：取一定量的競(jìng)爭(zhēng)DNA片段混合物----每個(gè)片段與各自對(duì)應(yīng)基因片段僅有微小差別（通常為幾個(gè)堿基長(zhǎng)度差異），然后與合適量的樣本DNA混合，作為隨后多重?zé)晒飧?jìng)爭(zhēng)性PCR擴(kuò)增的模板；多重PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳后對(duì)不同基因位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物以及同一位點(diǎn)的不同模板（樣本DNA與競(jìng)爭(zhēng)DNA）擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)其長(zhǎng)度差異進(jìn)行分離；分析每個(gè)基因片段的S/I值，利用參照基因S/I值對(duì)目標(biāo)基因S/I值進(jìn)行校正后獲取目標(biāo)基因的準(zhǔn)確拷貝數(shù)。 與其它拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)如qRT-PCR和MLPA相比，該檢測(cè)專(zhuān)利技術(shù)具備低成本、高效率、高準(zhǔn)確性的優(yōu)勢(shì)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI3130XL進(jìn)行毛細(xì)管電泳，原始數(shù)據(jù)文件采用GeneMapper4.0（Life technologies）進(jìn)行目標(biāo)峰高及峰面積數(shù)據(jù)讀取，輸出數(shù)據(jù)采用EXCEL進(jìn)行處理分析。  圖1： AccuCopy®多重CNV檢測(cè)技術(shù)原理:利用內(nèi)對(duì)照DNA校正不同片段的擴(kuò)增效率的差異，參照基因R來(lái)作為2拷貝的內(nèi)參基因，用于拷貝數(shù)絕對(duì)定量。數(shù)據(jù)處理時(shí)，使用目的峰面積S/內(nèi)對(duì)照DNA峰I，再用參照基因R進(jìn)行標(biāo)化2拷貝，目的基因片段的拷貝數(shù)便可以精確定量了。 應(yīng)用領(lǐng)域： 本方法適用于各個(gè)涉及到DNA拷貝數(shù)變異研究的遺傳研究領(lǐng)域，例如疾病基因組研究、腫瘤基因組研究、臨床分子診斷研究、植物基因組研究、動(dòng)物基因組研究等。尤其適合針對(duì)多個(gè)候選區(qū)域的DNA拷貝數(shù)分析，以及全基因組CNV研究后進(jìn)行進(jìn)一步的大樣品驗(yàn)證研究。
天昊生物自主專(zhuān)利技術(shù)
◣多重檢測(cè)可將12-16個(gè)片段融入1個(gè)檢測(cè)體系，其中8-12個(gè)檢測(cè)目的片段，3-4個(gè)參照基因片段。 ◣最為準(zhǔn)確的CNV拷貝數(shù)定量檢測(cè)方法，平均檢測(cè)誤差<5%。 ◣高靈敏度：可以準(zhǔn)確定量高達(dá)6個(gè)拷貝的目的片段。 ◣高通量：大樣品量多重CNV拷貝數(shù)檢測(cè)方法，4小時(shí)可以完成CNV拷貝數(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。 ◣低成本：無(wú)需大量重復(fù)，多重實(shí)驗(yàn)為您大大節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。 ◣高靈活性：可根據(jù)客戶需求進(jìn)行設(shè)計(jì)合成Customer Design Panel及試劑盒，您只需擁有熒光毛細(xì)管電泳儀就可以輕松實(shí)現(xiàn)高效的拷貝數(shù)多重檢測(cè)。省去繁瑣的國(guó)外定制流程，更快速、更便宜。 檢測(cè)對(duì)象： 基因組DNA 服務(wù)內(nèi)容：
檢測(cè)實(shí)例：
 圖1. AccuCopy®在1個(gè)體系中進(jìn)行10個(gè)目的片段多重定量檢測(cè)的熒光毛細(xì)管電泳圖。  圖2. AccuCopy®檢測(cè)實(shí)例I：染色體21、X、Y拷貝數(shù)檢測(cè)，參照基因POP1。
1. Du R, Lu C, Jiang Z , et al. Efficient typing of copy number variations in a segmental duplication-mediated rearrangement hotspot using multiplex competitive amplification. J Hum Genet. 2012 Aug; 57(8):545-51.
 2012年復(fù)旦大學(xué)張峰教授的研究團(tuán)隊(duì)與上海天昊生物科技有限公司合作，利用上海天昊專(zhuān)利的多重DNA拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)AccuCopy®對(duì)CNV產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行了深入的研究.研究者利用AccuCopy®這一基于多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)的檢測(cè)方法對(duì)320個(gè)精子發(fā)生減少病人和93個(gè)健康人,在MEIG1、NAHR基因中發(fā)現(xiàn)了一系列DNA缺失和重復(fù)。此研究第一次發(fā)表了AccuCopy®多重DNA拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)，并證實(shí)了這一技術(shù)在多重CNV檢測(cè)中高效性和準(zhǔn)確性。
2. Liu B, Yang L, Huang B, et al. A functional copy-number variation in MAPKAPK2 predicts risk and prognosis of lung cancer. Am J Hum Genet. 2012 Aug 10; 91(2):384-90.  2012年廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的呂嘉春教授團(tuán)隊(duì)利用天昊AccuCopy®技術(shù)對(duì)CNV在肺癌致病和預(yù)后中發(fā)揮的作用進(jìn)行了研究，研究成果發(fā)表在《美國(guó)人類(lèi)遺傳學(xué)雜志》上。MAPKAPK2 屬于MAPK通路，可以通過(guò)致癌作用和藥物抵抗促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和侵襲。研究者評(píng)估了位于MAPKAPK2啟動(dòng)子區(qū)域已知的拷貝數(shù)變異g.CNV-30450不同拷貝數(shù)在肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后中發(fā)揮的效應(yīng)。研究利用TaqMan定量PCR方法在4789個(gè)樣品中進(jìn)行了CNV分型，同時(shí)利用AccuCopy®和Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片進(jìn)了200個(gè)隨機(jī)樣品的驗(yàn)證，驗(yàn)證一致率高達(dá)98%。這一研究結(jié)果充分反映了AccuCopy®具有很高的檢測(cè)準(zhǔn)確性，同時(shí)AccuCopy®作為多重CNV檢測(cè)技術(shù)，具有TaqMan技術(shù)和全基因組芯片技術(shù)無(wú)法匹敵的檢測(cè)通量?jī)?yōu)勢(shì)。
3. Liu Y, Du Y, Liu W, et al. Lack of association between NLGN3, NLGN4, SHANK2 and SHANK3 gene variants and autism spectrum disorder in a Chinese population. PLoS One. 2013; 8(2):e56639.  復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院公曉紅教授的科研團(tuán)隊(duì)與上海天昊生物科技有限公司合作，利用AccuCopy®技術(shù)和Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)突觸NRXN-NLGN通路中相關(guān)基因進(jìn)行了基因突變和DNA拷貝數(shù)檢測(cè)，研究了這些基因與中國(guó)自閉癥譜系障礙患者的關(guān)聯(lián)，取得的科研成果于2013年2月發(fā)表在PLOS ONE雜志上。研究者利用AccuCopy®技術(shù)對(duì)NLGN3、NLGN4、SHANK2、SHANK3四個(gè)基因在285個(gè)病例中進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示病例中未發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因存在缺失和重復(fù)的情況。同時(shí)研究者通過(guò)測(cè)序和關(guān)聯(lián)分析也未發(fā)現(xiàn)這些基因中的位點(diǎn)與此疾病存在顯著關(guān)聯(lián)。研究提示突觸NRXN-NLGN通路這一重要ASD易感通路中的主要基因可能并非是中國(guó)人群ASD發(fā)病的主要病因。在這一研究中AccuCopy®充分發(fā)揮了其對(duì)CNV檢測(cè)的通量?jī)?yōu)勢(shì)，在大量樣品中同時(shí)對(duì)多個(gè)基因的不同片段區(qū)域進(jìn)行了DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)分析。  4. You GL, Ding QL, Lu YL, et al. Characterization of large deletions in the F8 gene using multiple competitive amplification and genome walking technique. J Thromb Haemost. 2013 Mar 29.  上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院王學(xué)峰教授團(tuán)隊(duì)利用AccuCopy®多重DNA拷貝檢測(cè)技術(shù)對(duì)F8 基因DNA拷貝數(shù)進(jìn)行了檢測(cè)，成功的對(duì)血友病A患者進(jìn)行了遺傳病因?qū)W的診斷，并使用引物步移法和染色體步移法技術(shù)對(duì)斷點(diǎn)進(jìn)行分子水平的特性研究。血友病A是人類(lèi)最常見(jiàn)的凝血機(jī)制障礙性疾病，呈X染色體連鎖隱性遺傳，由血漿凝血因子Ⅷ(F8)缺陷所致，因F8基因大片段缺失產(chǎn)生的病患數(shù)占重型血友病A的3%。研究者利用AccuCopy®技術(shù)對(duì)F8基因的26個(gè)外顯子進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了10種F8基因片段缺失情況，并檢測(cè)出4例家族中的女性攜帶者。研究者提出AccuCopy®可以高效地通過(guò)檢測(cè)大片段DNA拷貝數(shù)來(lái)進(jìn)行遺傳學(xué)病因診斷，在臨床分子診斷中具有巨大的優(yōu)勢(shì)。  |
