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人類SMN1/DMD/FRM1基因突變檢測試劑盒
假肥大性肌營養(yǎng)不良癥（DMD）是最常見的X連鎖隱性遺傳的肌病，發(fā)病率為1/3500活產(chǎn)男嬰，無明顯地理或種族差異，患兒多呈明顯家族性，另有1/3由新發(fā)突變而致病。DMD基因的突變是導(dǎo)致假肥大性肌營養(yǎng)不良癥的主要病因，最常見的類型是缺失型，約占55%~65%，以第44-45號、第2-19號外顯子間最為多見；基因重復(fù)占5%~15%；點(diǎn)突變占30%左右。
脊髓性肌萎縮癥（Spinal Muscular Atrophy，SMA）是一種源于脊髓前角退變引起肌無力和肌萎縮的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病，屬于常染色體隱性遺傳病?；町a(chǎn)嬰兒的發(fā)病率為1/6000~1/10000，人群攜帶者頻率為1/40~1/50，居兒童致死性常染色體遺傳病的第2位。運(yùn)動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）的外顯子純合缺失（90%~95%）或SMN1缺失/點(diǎn)突變（或部分缺失）（3~5%）的復(fù)合雜合突變是導(dǎo)致該疾病發(fā)生的主要原因。運(yùn)動神經(jīng)元存活基因2（SMN2）基因會轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生10~20%全長有功能的轉(zhuǎn)錄本，因此在SMA病人中，SMN2基因拷貝數(shù)與臨床表型嚴(yán)重程度密切相關(guān)。
脆性X綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是最常見的X連鎖隱性遺傳的單基因性智力低下綜合征，占所有X-連鎖智力低下疾病的15%~25%，發(fā)病率僅低于21-三體綜合征。超過99%的脆性X綜合征患者是由FMR1基因三核苷酸重復(fù)序列（CGG）n擴(kuò)增和超甲基化所致。全突變（n≥200）的患者多為男性，在男性人群中的發(fā)病率為1/6000~1/4000，女性的發(fā)病率約為1/8000。全突變的男性患者及部分女性患者將智力低下生活無法自理，終身無法治愈，給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。FMR1基因的前突變（n＝55~199）與女性卵巢儲備功能下降、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、卵巢功能早衰、不孕不育、IVF失敗有關(guān)，與男性成年后的震顫/共濟(jì)失調(diào)有關(guān)。55xCGG重復(fù)是一個分水嶺，小于55x個體表型通常正常，后代發(fā)生突變的可能性也很低，但大于55x是前突變/全突變攜帶者或患者，而且后代傳遞中有較高頻率突變?yōu)槿蛔儚亩a(chǎn)生更為嚴(yán)重的臨床癥狀。
上述三種遺傳病發(fā)病率高、致死/致殘率高，幾乎沒有有效的治療手段，但卻是可以通過對備孕人群或已妊娠人群進(jìn)行對應(yīng)基因的突變篩查預(yù)防絕大部分患兒的出生。美國婦產(chǎn)科年會（ACOG）在“基因組醫(yī)學(xué)時代下的攜帶者篩查”的專家共識中，脆性X綜合征和脊髓性肌萎縮癥是向所有備孕人群或已妊娠人群強(qiáng)烈推薦篩查的2種疾病。
人類SMN1/DMD/FMR1基因突變檢測試劑盒通過采集人基因組DNA，應(yīng)用公司自主研發(fā)且具有自主知識產(chǎn)權(quán)的AccuCopy®多重?zé)晒飧偁幮訮CR（授權(quán)專利號：ZL201010180551.2，Du etal，2012）用于SMA（SMN1及SMN2）和DMD基因的拷貝數(shù)檢測。應(yīng)用特殊熒光CGG重復(fù)PCR技術(shù)來進(jìn)行FXS的FMR1 CGG重復(fù)數(shù)的檢測。該檢測產(chǎn)品主要的展開領(lǐng)域?yàn)閶D產(chǎn)科，作為SMA/DMD/FXS的攜帶者篩查對所有備孕期或孕早期的女性進(jìn)行普篩，篩查出高危人群，及時進(jìn)行產(chǎn)前診斷，有效避免嚴(yán)重遺傳病患兒的出生。
對于DMD，檢測高頻突變的34個外顯子的拷貝數(shù)，預(yù)計(jì)能覆蓋現(xiàn)有報(bào)導(dǎo)95%以上的拷貝數(shù)變異，若檢測到陽性樣本，可采用本公司“人類DMD基因突變檢測試劑盒”驗(yàn)證，該試劑盒覆蓋全部79個外顯子，可進(jìn)一步明確具體的缺失范圍。此外，該三聯(lián)檢試劑盒中包含的20個點(diǎn)突變位點(diǎn)均為文獻(xiàn)報(bào)道5次以上的熱點(diǎn)突變，可進(jìn)一步提高3~5%檢出率。
對于SMA，可檢測SMN1及SMN2的拷貝數(shù)，部分外顯子缺失重復(fù)突變以及10個高頻點(diǎn)突變，其中含3個歐洲人群特有高頻位點(diǎn)。此外，該試劑盒還可對g.27134T＞G進(jìn)行分型，該SNP位點(diǎn)的G等位基因據(jù)報(bào)道與雙SMN1基因連鎖顯著相關(guān)，檢出該G等位基因的SMN1拷貝數(shù)為2的個體可能為2+0型高危個體，建議進(jìn)行父母檢測輔助分析排除。
對于FMR1，主要檢測FMR1基因的CGG重復(fù)數(shù)，通過本項(xiàng)檢測可判斷是否存在大于或等于55x的重復(fù)突變。對于陽性樣本，建議采用美國進(jìn)口AmplideX試劑盒進(jìn)行CGG具體重復(fù)數(shù)的確認(rèn)。
SMN1、SMN2和DMD基因的拷貝數(shù)檢測采用的是公司自主研發(fā)且具有自主知識產(chǎn)權(quán)的AccuCopy®多重?zé)晒飧偁幮訮CR技術(shù)；SMN1和DMD的點(diǎn)突變檢測則采用多重?zé)晒釧RMS法；FMR1 CGG 重復(fù)突變篩查采用特殊熒光CGG重復(fù)PCR法。
通過取一定量的競爭性DNA片段混合物（每個競爭性DNA片段與各自對應(yīng)基因片段通常僅有2-3bp差別），然后與合適量的檢測樣本DNA混合，隨后利用多重?zé)晒釶CR引物對檢測樣本DNA及競爭性DNA片段混合物進(jìn)行參照基因片段和目標(biāo)基因片段的擴(kuò)增；多重PCR產(chǎn)物經(jīng)熒光毛細(xì)管電泳后根據(jù)擴(kuò)增長度差異進(jìn)行分離，獲取不同基因片段的檢測樣本峰（S）以及競爭性DNA峰（C）的峰高值；分析每個基因片段的S/C峰高比值（稱R值），然后將目標(biāo)基因R值除以參照基因R值獲得RR值(用于校正不同檢測樣本DNA用量差異)，通過將檢測樣本的RR值除以參照樣本的RR值（用于校正不同基因片段對應(yīng)競爭性DNA的用量差異）后再乘以參照樣本在該目標(biāo)基因上的拷貝數(shù)即可獲得目標(biāo)基因的精確拷貝數(shù)。
一個樣本需要4個擴(kuò)增反應(yīng)，最后2個毛細(xì)管電泳。
