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技術(shù)參數(shù)與實驗流程
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技術(shù)參數(shù)

樣本要求	測序策略	數(shù)據(jù)要求
樣品類型：完整無DNA污染的Total RNA； 樣本起始量 (單次)：≥ 3 μg /樣本； 樣本濃度：建議介于≥ 50 ng/μL； 樣本純度：OD260/280 ≥ 1.8；28S/18S ≥ 1.5； 樣本完整度：2100 Bioanalyzer RIN值 ≥ 8.0；	Hiseq 2×150	Q30>80% rRNA比例低于rawdata 的3% 單個樣本數(shù)據(jù)量可為3/5/10G，根據(jù)客戶需求選擇

經(jīng)典文章解讀
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案例：早期發(fā)育的玉米種子胚與胚乳的差異轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)

背景：玉米是世界上最重要的糧食作物，玉米種子的發(fā)育開始于雙受精，雙受精后由合子發(fā)育成胚，中央細(xì)胞發(fā)育成胚乳。胚乳的主要功能是提供為胚的萌發(fā)和發(fā)育提供營養(yǎng)。目前，一個完整的胚和胚乳的轉(zhuǎn)錄譜仍然缺乏。胚和胚乳的轉(zhuǎn)錄組分析可以從本質(zhì)上了解這兩種組織的發(fā)育過程。

方法：研究人員收集了授粉后9天的玉米胚乳和胚，然后進(jìn)行mRNA-seq，預(yù)測了新的轉(zhuǎn)錄區(qū)域、選擇性剪切、反式剪切；并通過RT-PCR驗證轉(zhuǎn)錄本和反式剪切事件的準(zhǔn)確性；然后進(jìn)行了胚乳和胚差異表達(dá)基因分析，GO分析，聚類分析；并對轉(zhuǎn)錄因子及其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進(jìn)行分析。

結(jié)果：

• 預(yù)測新的轉(zhuǎn)錄本


•         •  68.1%，28.8%，3.3%的reads分別可以比對到外顯子，結(jié)合區(qū)以及基因間隔區(qū)。RNA-seq測到的剪接位點和外顯子有一部分是和注釋是不重疊的，說明存在新的轉(zhuǎn)錄本。
•         •  通過新方法鑒定1286個新轉(zhuǎn)錄區(qū)域，這些新轉(zhuǎn)錄區(qū)域與有注釋的轉(zhuǎn)錄本相比，具有更少的外顯子，并且新轉(zhuǎn)錄本的長度是有注釋的轉(zhuǎn)錄本的一半，雖然和有注釋的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量相差不多，但是這些新轉(zhuǎn)錄區(qū)域的表達(dá)在胚和胚乳中是相差很大的。
•         •  通過RNA-seq數(shù)據(jù)預(yù)測到一個新轉(zhuǎn)錄區(qū)域含有9個轉(zhuǎn)錄本，其中5個轉(zhuǎn)錄本只在胚中存在，另外4個轉(zhuǎn)錄本只在胚乳中存在。另外這兩大類轉(zhuǎn)錄本主要在兩個結(jié)合區(qū)有明顯區(qū)別。
•         •  通過RT-PCR對這些新轉(zhuǎn)錄區(qū)域進(jìn)行了驗證，實驗表明大部分新轉(zhuǎn)錄區(qū)域都可以通過RT-PCR 驗證到。

• 預(yù)測新的選擇性剪切


•         •  發(fā)現(xiàn)50.7% 的多外顯子基因存在選擇性剪切，并且不同轉(zhuǎn)錄本有組織特異性。
•         •  通過計算分析，存在8種不同的選擇性剪切方式， 其中Retained intron 是主要方式，并且這些剪切方式在胚的數(shù)目是要比在胚中多，預(yù)示選擇性剪切在種子發(fā)育過程中非常重要。
•         •  通過計算，發(fā)現(xiàn)有9個染色體內(nèi)的反式剪切，37個染色體間的反式剪切。在染色體內(nèi)的剪切中，有一部分來自相鄰的基因剪切，還有一部分來自遙遠(yuǎn)的基因剪切。這些不同的反式剪切方式在胚乳和胚中是不同的。通過RT-PCR對這些反式剪切轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了驗證，證明了RNA-seq結(jié)果是可靠的。

• 胚乳和胚差異表達(dá)基因分析，GO分析，聚類分析


•         •  發(fā)現(xiàn)在胚中表達(dá)的基因數(shù)目要多于胚乳。共鑒定到2982個在胚和胚乳中差異表達(dá)的基因，其中在胚乳中上調(diào)的基因主要參與儲存營養(yǎng)，儲存能量以及碳水化合物的基因編碼。而在胚中上調(diào)的基因主要參與染色質(zhì)調(diào)控，核小體組裝，DNA的包裝和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物過程。

• 轉(zhuǎn)錄因子及其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的分析


•         •  937個轉(zhuǎn)錄因子在胚和胚乳中呈現(xiàn)特異性表達(dá)，在胚中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子具有各種各樣的功能，例如參與表觀遺傳，跨代編輯，細(xì)胞分化，激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞命運決定等。
•         •  另外發(fā)現(xiàn)了參與小RNA途徑的調(diào)控元件，例如DCL，AGO在胚中是高表達(dá)的，預(yù)示著小RNA途徑對胚的發(fā)育非常重要。

經(jīng)典文章解讀
Lu X ., et al., The Differential Transcription Network between Embryo and Endosperm in the Early Developing Maize Seed..Plant Physiol, 2013 May;162(1):440-55.