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全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)介紹
***************************************************************************************************** 技術(shù)簡(jiǎn)介： 全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（whole genome bisulfite Sequencing）是基于重亞硫酸鹽的甲基化分析方法，首先通過(guò)重亞硫酸鹽對(duì)樣本DNA進(jìn)行處理，將未甲基化的C堿基轉(zhuǎn)化為U堿基，而甲基化的C堿基則不會(huì)改變，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后U堿基會(huì)變成T，與原本甲基化的C堿基區(qū)分開(kāi)，再結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，可繪制單堿基分辨率的全基因組DNA甲基化圖譜。 應(yīng)用領(lǐng)域：
技術(shù)參數(shù)與實(shí)驗(yàn)流程
***************************************************************************************************** 技術(shù)參數(shù)
實(shí)驗(yàn)流程 A. 建庫(kù)測(cè)序流程  B. 數(shù)據(jù)分析流程 
經(jīng)典文章解讀 背景：啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，但甲基化的程度和表達(dá)抑制程度的關(guān)系仍不明確；此外，啟動(dòng)子區(qū)和基因主體區(qū)的甲基化功能相關(guān)性也不明確。 方法：Trio家系三個(gè)樣本外周血單核白細(xì)胞提取RNA和DNA，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和全基因組甲基化測(cè)序。 結(jié)果：
圖一：基因表達(dá)和甲基化程度呈現(xiàn)明顯的L形狀模式。即極端高表達(dá)的基因甲基化程度很低，極端低表達(dá)的基因甲基化程度很高。
圖二：基于隨機(jī)森林的表達(dá)模型發(fā)現(xiàn)，對(duì)于基因整體表達(dá)高低，基因本體甲基化程度比啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的指標(biāo)作用更佳
案例2：番茄果實(shí)發(fā)育的單堿基分辨率甲基化譜揭示與成熟相關(guān)的表觀修飾 背景：番茄果實(shí)的成熟是由植物激素乙烯引發(fā)，但它的影響受一個(gè)未知的發(fā)育線索所限制，為了確定這個(gè)未知的發(fā)育線索是否涉及表觀遺傳重塑，本研究對(duì)番茄用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)果實(shí)提前成熟。通過(guò)對(duì)對(duì)果實(shí)發(fā)育中從不成熟到完全成熟的4個(gè)階段番茄果實(shí)進(jìn)行全基因組甲基化測(cè)序，數(shù)據(jù)表明，表觀基因組在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中不能是靜態(tài)的，可能已被選擇用于確保發(fā)育過(guò)程的保真度。 方法： 研究人員對(duì)果實(shí)發(fā)育中從不成熟到完全成熟的4個(gè)階段番茄果實(shí)（17d，39d，42d，52d），2個(gè)成熟缺陷變異株 (Cnr和rin變異) 的成熟期果實(shí)和1個(gè)野生型番茄葉片進(jìn)行全基因組甲基化測(cè)序，測(cè)序深度為10×。 結(jié)果：
 
圖一： 番茄的表觀基因組圖譜
圖二：不同組織、發(fā)育時(shí)期的甲基化差異
 
圖三： RIN結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域特征
參考文獻(xiàn)： Zhang S., et al., Single-base resolution methylomes of tomato fruit development reveal epigenome modifications associated with ripening. Nature biotechnology, 2013 Feb;31(2):154-9. |
